【视频】原代培养小鼠耳蜗Corti器-XiaLab瑞哈娜
在所有哺乳动物中，用于听觉感觉上皮位于内耳耳蜗的Corti器中。耳蜗中的毛细胞是听觉系统的感觉细胞。毛细胞将声音引起的基底膜机械振动转换为大脑神经冲动。玖竜在大多数情况下，感音神经性听力损失是由于耳蜗毛细胞的死亡或功能障碍引起的。在听觉研究中，Corti器外植体的分离和体外培养越来越重要。Corti器外植体可用于基因表达，静纤毛运动，细胞和分子生物学宋梓南，以及毛细胞再生的生物学方法等实验应用研究。本方案描述了从新生小鼠中分离和培养Corti器官的方法。使用该方法，可将原代外植体维持7-10天。
耳及Corti器的解剖结构
Corti器的原代培养
一、第1天 盖玻片的灭菌和涂层
1.在高压灭菌显微镜盖玻片狮跑沙滩车 。将灭菌的盖玻片放入四孔细胞培养皿中。
2.在盖玻片上加入含20％胎牛血清（FBS）的1：1 poly-L-ornithine 和laminin 4℃过夜。提前准备400μL poly-L-ornithine（0.01％溶液，4°C保存）400μLlaminin（50μg/ mL储备液在-20°C下以等分储存），200μL FBS（以-20°C的等分储存）
3.灭菌解剖器械。
4.制备含有10％血清和10mg / mL氨苄青霉素的培养基：90 mL Dulbecco's改良Eagle培养基，5 mL FBS（-20°C等分储存），5 mL马血清（-20°C等分储存），10μL氨苄青霉素（10 mg / mL储备液，4°C储存）
二、第2天 分离Corti器
1.打开紫外灯消毒20分钟，用70％乙醇喷洒所有超净台表面，等待5分钟后再使用。
2.使用手术剪刀在枕骨大孔底部剪下出生后4天（P4）的小鼠头部。在10cm培养皿中用70％乙醇的冲洗消毒头部。
3.使用手术刀去除表皮巴氏消毒液，沿矢状缝打开颅骨，然后将前脑切成两半。保留前脑尾部进一步解剖亚冠决赛第二回合。使用钝性分离去除前脑，小脑和脑干。去除颞骨傻夫吴望，将它们短暂浸入70％乙醇中，然后转移到含有无菌HBSS的3 cm培养皿中。使用镊子移除颞骨上的组织全球怪物在线。找到海螺形耳蜗并使用镊子将其与前庭系统分开。
4.在P4发育阶段，骨质迷路没有完全钙化，很容易用镊子解剖。使用镊子通过从基端开始仔细分离移除耳蜗的骨质迷路澄合网 。
5. Corti的螺旋韧带和附着器官沿着蜗轴螺旋盘绕商海谍影 ，使用镊子固定基部的螺旋韧带钩状区域，小心地移除Corti器官佛萨 。从基部开始，使用＃55细镊子从Corti器官上取下螺旋韧带。选择性微量分离Corti感觉上皮器官天朝王国 。
6.使用两个?cc胰岛素注射器取下基部Corti钩区的器官九寨之子 ，用U-100 28G小丈夫秋月 ?针作为镊子。
7.从顶点开始，从内毛细胞排中取出螺旋状边缘，然后进行基倩男幽魂础（图2E-F）。平铺Corti外植体器官易学堂。
8.取出培养孔中的poly-L-ornithine /laminin / FBS溶液冰超兽冰龙，加入130μl培养基。
9.将解剖的Corti器官转移到培养孔中的盖玻片上，并使外植体毛细胞的纤毛朝上倒鸭子 。
10.使用200μL移液器移除培养孔中的培养基。确保基底膜与涂层玻璃盖玻片牢固接触。
11. 使用200 mL移液器小心地将130μL培养基添加到Corti器官中（在Corti器官的表面上涂两滴，然后将剩余的体积缓慢加到盖玻片的侧面。确保Corti器官不会漂浮在培养基中，但仍粘在盖玻片上海马歌舞厅。）
12.在5％CO 2 37℃培养箱孵育过夜。即可做后续实验。
参考文献及网站
1.Parker M水儿武士, Brugeaud A, Edge AS. Primary culture and plasmid electroporation ofthe murine organ of Corti. J Vis Exp. 2010 Feb 4;(36). pii: 1685. doi:10.3791/1685.
2.https://www.britannica.com/science/basilar-membrane#